Ժամանակակից կենսաբանությունը հիացնում է իր հայտնագործությունների յուրահատկությամբ և մասշտաբով: Այսօր այս գիտությունն ուսումնասիրում է այն գործընթացների մեծ մասը, որոնք թաքնված են մեր աչքերից։ Սա ուշագրավ է մոլեկուլային կենսաբանության համար՝ խոստումնալից ոլորտներից մեկը, որն օգնում է բացահայտել կենդանի նյութի ամենաբարդ առեղծվածները:
Ինչ է հակադարձ տառադարձումը
Հակադարձ արտագրումը (կրճատ՝ RT) հատուկ գործընթաց է, որը բնորոշ է ՌՆԹ վիրուսների մեծամասնությանը: Դրա հիմնական առանձնահատկությունը ԴՆԹ-ի երկշղթա մոլեկուլի սինթեզն է՝ հիմնված սուրհանդակային ՌՆԹ-ի վրա։
OT-ը բնորոշ չէ բակտերիաներին կամ էուկարիոտիկ օրգանիզմներին: Հիմնական ֆերմենտը` ռեվերսետազը, առանցքային դեր է խաղում երկշղթա ԴՆԹ-ի սինթեզում:
Հայտնաբերման պատմություն
Գաղափարը, որ ռիբոնուկլեինաթթվի մոլեկուլը կարող է դառնալ ԴՆԹ սինթեզի ձևանմուշ, համարվում էր անհեթեթ մինչև 1970-ականները: Հետո Բալթիմորը և Թեմինը, աշխատելով միմյանցից առանձին, գրեթե միաժամանակ հայտնաբերեցին նոր ֆերմենտ։ Նրանք այն անվանեցին ՌՆԹ-ից կախված-ԴՆԹ պոլիմերազ կամ հակադարձ տրանսկրիպտազ:
Այս ֆերմենտի հայտնաբերումն անվերապահորեն հաստատեց օրգանիզմների գոյությունըհակադարձ արտագրման ունակ: Երկու գիտնականներն էլ Նոբելյան մրցանակ են ստացել 1975 թվականին։ Որոշ ժամանակ անց Էնգելհարդն առաջարկեց հակադարձ տրանսկրիպտազի այլընտրանքային անվանում՝ ռեվերտազ:
Ինչու OT-ը հակասում է մոլեկուլային կենսաբանության կենտրոնական դոգմային
Կենտրոնական դոգման ցանկացած կենդանի բջիջում սպիտակուցի հաջորդական սինթեզի հասկացությունն է: Նման սխեման կառուցված է երեք բաղադրիչներից՝ ԴՆԹ, ՌՆԹ և սպիտակուց։
Համաձայն կենտրոնական դոգմայի՝ ՌՆԹ-ն կարող է սինթեզվել բացառապես ԴՆԹ-ի կաղապարի վրա, և միայն դրանից հետո ՌՆԹ-ն ներգրավված է սպիտակուցի առաջնային կառուցվածքի կառուցման մեջ:
Այս դոգման պաշտոնապես ընդունված էր գիտական հանրության մեջ մինչև հակադարձ տառադարձության հայտնաբերումը: Զարմանալի չէ, որ ՌՆԹ-ից ԴՆԹ-ի հակադարձ սինթեզի գաղափարը երկար ժամանակ մերժվել է գիտնականների կողմից: Միայն 1970 թվականին, ռեվերսետազի հայտնաբերման հետ մեկտեղ, վերջ դրվեց այս խնդրին, որն արտացոլվեց սպիտակուցի սինթեզի հայեցակարգում:
Թռչնագրիպի ռետրովիրուսների վերականգնում
Հակադարձ տրանսկրիպցիայի գործընթացը ամբողջական չէ առանց ՌՆԹ-կախյալ-ԴՆԹ պոլիմերազի մասնակցության: Թռչնի ռետրովիրուսի ռեվերտազը մինչ օրս ուսումնասիրվել է առավելագույն չափով:
Այս սպիտակուցի միայն մոտ 40 մոլեկուլ կարելի է գտնել այս ընտանիքի վիրուսների մեկ վիրուսում: Սպիտակուցը բաղկացած է երկու ենթամիավորներից, որոնք հավասար թվով են և կատարում են հակադարձման երեք կարևոր գործառույթ՝
1) ԴՆԹ-ի մոլեկուլի սինթեզ ինչպես միաշղթա/երկաշղթա ՌՆԹ կաղապարի, այնպես էլ դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթուների հիման վրա։
2) RNase H ակտիվացում, որի հիմնական դերըՌՆԹ-ի մոլեկուլի ճեղքումը ՌՆԹ-ԴՆԹ համալիրում։
3) ԴՆԹ-ի մոլեկուլների հատվածների ոչնչացում էուկարիոտների գենոմում տեղադրելու համար:
Մեխանիզմ OT
Հակադարձ տառադարձման քայլերը կարող են տարբեր լինել՝ կախված վիրուսների ընտանիքից, այսինքն. դրանց նուկլեինաթթուների տեսակի վրա։
Եկեք նախ դիտարկենք այն վիրուսները, որոնք օգտագործում են ռեվերսետազ: Այստեղ OT գործընթացը բաժանված է 3 քայլի.
1) «-» ՌՆԹ շղթայի սինթեզ ՌՆԹ շղթայի «+» ձևանմուշի վրա։
2) ՌՆԹ-ի «+» շղթայի ոչնչացում ՌՆԹ-ԴՆԹ համալիրում՝ օգտագործելով RNase H ֆերմենտը:
3) ԴՆԹ-ի երկշղթա մոլեկուլի սինթեզ ՌՆԹ շղթայի «-» ձևանմուշի վրա։
Վիրիոնի վերարտադրման այս մեթոդը բնորոշ է որոշ օնկոգեն վիրուսների և մարդու իմունային անբավարարության վիրուսի (ՄԻԱՎ):
Հարկ է նշել, որ ՌՆԹ կաղապարի վրա ցանկացած նուկլեինաթթվի սինթեզի համար անհրաժեշտ է սերմ կամ այբբենարան: Պրայմերը նուկլեոտիդների կարճ հաջորդականություն է, որը լրացնում է ՌՆԹ-ի մոլեկուլի (կաղապարի) 3' ծայրին և կարևոր դեր է խաղում սինթեզը սկսելու գործում:
Երբ վիրուսային ծագման պատրաստի երկշղթա ԴՆԹ-ի մոլեկուլները ինտեգրվում են էուկարիոտների գենոմում, սկսվում է վիրուսի սպիտակուցի սինթեզի սովորական մեխանիզմը։ Արդյունքում, վիրուսի կողմից «գրավված» բջիջը վերածվում է վիրիոնների արտադրության գործարանի, որտեղ մեծ քանակությամբ ձևավորվում են անհրաժեշտ սպիտակուցներ և ՌՆԹ մոլեկուլներ։
Հակադարձ տրանսկրիպցիայի մեկ այլ եղանակ հիմնված է ՌՆԹ սինթետազի գործողության վրա: Այս սպիտակուցը ակտիվ է պարամիքսովիրուսների, ռաբդովիրուսների, պիկորնովիրուսների մեջ: Այս դեպքում չկա OT-ի երրորդ փուլ՝ ձեւավորումըկրկնակի շղթա ունեցող ԴՆԹ, և փոխարենը «+» ՌՆԹ շղթան սինթեզվում է վիրուսային «-» ՌՆԹ շղթայի ձևանմուշի վրա և հակառակը։
Նման ցիկլերի կրկնությունը հանգեցնում է և՛ վիրուսի գենոմի բազմացմանը, և՛ վարակված էուկարիոտիկ բջջի պայմաններում սպիտակուցի սինթեզի ընդունակ mRNA-ի ձևավորմանը::
Հակադարձ տրանսկրիպցիայի կենսաբանական նշանակությունը
ՕՏ գործընթացն առաջնային նշանակություն ունի բազմաթիվ վիրուսների (հիմնականում ռետրովիրուսների, օրինակ՝ ՄԻԱՎ-ի) կյանքի ցիկլում: Վիրիոնի ՌՆԹ-ն, որը հարձակվել է էուկարիոտական բջիջի վրա, դառնում է ԴՆԹ-ի առաջին շղթայի սինթեզի ձևանմուշ, որի վրա դժվար չէ լրացնել երկրորդ շարանը:
Վիրուսի ստացված երկշղթա ԴՆԹ-ն ինտեգրվում է էուկարիոտային գենոմի մեջ, ինչը հանգեցնում է վիրուսի սպիտակուցի սինթեզի գործընթացների ակտիվացմանը և վարակված բջջի ներսում դրա մեծ թվով կրկնօրինակների առաջացմանը։ Սա Revertase-ի և ընդհանրապես OT-ի հիմնական առաքելությունն է վիրուսի համար:
Հակադարձ արտագրումը կարող է տեղի ունենալ նաև էուկարիոտների մոտ՝ ռետրոտրանսպոզոնների՝ շարժական գենետիկ տարրերի համատեքստում, որոնք կարող են ինքնուրույն տեղափոխել գենոմի մի մասից մյուսը: Նման տարրերը, ըստ գիտնականների, առաջացրել են կենդանի օրգանիզմների էվոլյուցիան։
Ռետրոտրանսպոզոնը էուկարիոտիկ ԴՆԹ-ի մի հատված է, որը ծածկագրում է մի քանի սպիտակուցներ: Դրանցից մեկը՝ ռեվերսետազը, անմիջականորեն մասնակցում է նման ռետրոտրանսպորոզոնի տեղակայմանը։
ՕՏ-ի օգտագործումը գիտության մեջ
Այն պահից, երբ ռեվերսետազը մեկուսացվեց իր մաքուր տեսքով, հակադարձ տրանսկրիպցիայի գործընթացը ընդունվեց կենսաբանների կողմից:OT մեխանիզմի ուսումնասիրությունը դեռևս օգնում է կարդալ մարդկային ամենակարևոր սպիտակուցների հաջորդականությունը:
Փաստն այն է, որ էուկարիոտների գենոմը, ներառյալ մենք, պարունակում է ոչ տեղեկատվական տարածքներ, որոնք կոչվում են ինտրոններ: Երբ այդպիսի ԴՆԹ-ից ընթերցվում է նուկլեոտիդային հաջորդականություն և ձևավորվում է միաշղթա ՌՆԹ, վերջինս կորցնում է ինտրոններ և ծածկագրեր բացառապես սպիտակուցի համար։ Եթե ԴՆԹ-ն սինթեզվում է ռեվերսետազի միջոցով ՌՆԹ կաղապարի վրա, ապա հեշտ է այն հաջորդականացնել և պարզել նուկլեոտիդների կարգը։
Նուկլեինաթթուն, որը ձևավորվել է հակադարձ տրանսկրիպտազի միջոցով, կոչվում է cDNA: Այն հաճախ օգտագործվում է պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի մեջ (PCR)՝ արդյունքում ստացված cDNA պատճենի պատճենների թիվը արհեստականորեն մեծացնելու համար: Այս մեթոդը կիրառվում է ոչ միայն գիտության մեջ, այլև բժշկության մեջ. լաբորանտները որոշում են նման ԴՆԹ-ի նմանությունը տարբեր բակտերիաների կամ վիրուսների գենոմների հետ ընդհանուր գրադարանից։ Վեկտորների սինթեզը և դրանց ներմուծումը բակտերիաների մեջ կենսաբանության խոստումնալից ոլորտներից է։ Եթե RT-ն օգտագործվում է առանց ինտրոնների մարդկանց և այլ օրգանիզմների ԴՆԹ-ն ձևավորելու համար, ապա այդպիսի մոլեկուլները հեշտությամբ կարող են ներթափանցվել բակտերիաների գենոմի մեջ: Այսպիսով, վերջիններս դառնում են մարդուն անհրաժեշտ նյութերի (օրինակ՝ ֆերմենտների) արտադրության գործարաններ։
