Մոլեկուլային կենսաբանական հետազոտության մեթոդները մեծ դեր են խաղում ժամանակակից բժշկության, դատաբժշկական և կենսաբանության մեջ: ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի ուսումնասիրության առաջընթացի շնորհիվ մարդը կարողանում է ուսումնասիրել օրգանիզմի գենոմը, որոշել հիվանդության հարուցիչը, ճանաչել ցանկալի նուկլեինաթթուն թթուների խառնուրդում և այլն:
Մոլեկուլային կենսաբանական հետազոտության մեթոդներ. Ի՞նչ է դա:
Դեռևս 70-ական և 80-ական թվականներին գիտնականներին առաջին անգամ հաջողվեց վերծանել մարդու գենոմը: Այս իրադարձությունը խթան հաղորդեց գենետիկական ինժեներիայի և մոլեկուլային կենսաբանության զարգացմանը: ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի հատկությունների ուսումնասիրությունը հանգեցրել է նրան, որ այժմ հնարավոր է օգտագործել այդ նուկլեինաթթուները հիվանդությունը ախտորոշելու, գեները ուսումնասիրելու համար։
ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի ստացում
Մոլեկուլային կենսաբանական ախտորոշման մեթոդները պահանջում են սկզբնական նյութի առկայություն՝ ավելի հաճախ դա նուկլեինաթթուներ են։ Այս նյութերը կենդանի օրգանիզմների բջիջներից մեկուսացնելու մի քանի եղանակ կա։ Նրանցից յուրաքանչյուրն ունի իր առավելություններն ու թերությունները, և դա անհրաժեշտ էհաշվի առեք մաքուր նուկլեինաթթուների մեկուսացման մեթոդ ընտրելիս:
1. ԴՆԹ-ի ստացում ըստ Մարմուրի. Մեթոդը բաղկացած է նյութերի խառնուրդը սպիրտով մշակելուց, որի արդյունքում մաքուր ԴՆԹ նստվածք է առաջանում։ Այս մեթոդի թերությունը ագրեսիվ նյութերի՝ ֆենոլի և քլորոֆորմի օգտագործումն է։
2. ԴՆԹ-ի մեկուսացում ըստ Բումի. Այստեղ օգտագործվող հիմնական նյութը գուանիդին թիոցիանատն է (GuSCN): Այն նպաստում է դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի նստեցմանը մասնագիտացված սուբստրատների վրա, որոնցից այն կարող է հետագայում հավաքվել հատուկ բուֆերի միջոցով: Այնուամենայնիվ, GuSCN-ը PTC-ի արգելակող է, և դրա նույնիսկ մի փոքր մասը, որը մտնում է նստվածքային ԴՆԹ-ի մեջ, կարող է ազդել պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի ընթացքի վրա, որը կարևոր դեր է խաղում նուկլեինաթթուների հետ աշխատելու գործում::
3. Կեղտերի նստվածք. Մեթոդը նախորդներից տարբերվում է նրանով, որ նստվածք են ստանում ոչ թե դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի մոլեկուլները, այլ կեղտերը։ Դրա համար օգտագործվում են իոնափոխանակիչներ: Թերությունն այն է, որ ոչ բոլոր նյութերը կարող են նստել:
4. Զանգվածային ցուցադրություն. Այս մեթոդը կիրառվում է այն դեպքերում, երբ ԴՆԹ-ի մոլեկուլի բաղադրության մասին ճշգրիտ տեղեկատվություն անհրաժեշտ չէ, սակայն անհրաժեշտ է ստանալ որոշակի վիճակագրական տվյալներ։ Սա բացատրվում է նրանով, որ նուկլեինաթթվի կառուցվածքը կարող է վնասվել լվացող միջոցներով, մասնավորապես՝ ալկալիներով մշակելիս։
Հետազոտության մեթոդների դասակարգում
Մոլեկուլային կենսաբանական հետազոտության բոլոր մեթոդները բաժանված են երեք մեծ խմբերի.
1. Ուժեղացում (օգտագործելով բազմաթիվ ֆերմենտներ): Այստեղվերաբերում է PCR - պոլիմերազային շղթայական ռեակցիային, որը մեծ դեր է խաղում ախտորոշման շատ մեթոդներում։
2. Ոչ ուժեղացնող: Մեթոդների այս խումբն ուղղակիորեն կապված է նուկլեինաթթուների խառնուրդների աշխատանքի հետ։ Օրինակներ են՝ 3 բլոտ, in situ հիբրիդացում և այլն։
3. Մեթոդներ, որոնք հիմնված են զոնդի մոլեկուլից ազդանշանի ճանաչման վրա, որը կապվում է հատուկ զոնդի ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի հետ: Օրինակ՝ հիբրիդային գրավման համակարգը (hc2):
Ֆերմենտներ, որոնք կարող են օգտագործվել մոլեկուլային կենսաբանության հետազոտության մեթոդներում
Մոլեկուլային ախտորոշման շատ մեթոդներ ներառում են ֆերմենտների լայն շրջանակի օգտագործում: Ստորև ներկայացված են առավել հաճախ օգտագործվողները՝
1. Սահմանափակող ֆերմենտ - «կտրում» է ԴՆԹ-ի մոլեկուլը անհրաժեշտ մասերի։
2. ԴՆԹ պոլիմերազ - սինթեզում է դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի երկշղթա մոլեկուլ:
3. Հակադարձ տրանսկրիպտազ (վերվերտազ) - օգտագործվում է ՌՆԹ-ի ձևանմուշի վրա ԴՆԹ սինթեզելու համար:
4. ԴՆԹ լիգազ - պատասխանատու է նուկլեոտիդների միջև ֆոսֆոդիստերային կապերի ձևավորման համար:
5. Էկզոնուկլեազ - հեռացնում է նուկլեոտիդները դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի մոլեկուլի վերջնական հատվածներից:
PCR-ը ԴՆԹ-ի ուժեղացման հիմնական մեթոդն է
Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) ակտիվորեն օգտագործվում է ժամանակակից մոլեկուլային կենսաբանության մեջ: Սա մի մեթոդ է, որով ԴՆԹ-ի մեկ մոլեկուլից կարելի է ձեռք բերել հսկայական թվով պատճեններ (մոլեկուլները ուժեղացվում են):
PCR-ի հիմնական գործառույթները՝
- ախտորոշումհիվանդություններ;
- ԴՆԹ-ի հատվածների, գեների կլոնավորում:
Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան իրականացնելու համար անհրաժեշտ են հետևյալ տարրերը՝ սկզբնական ԴՆԹ մոլեկուլ, ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազ (Taq կամ Pfu), դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդ ֆոսֆատներ (ազոտային հիմքերի աղբյուրներ), պրայմերներ (2 պրայմեր 1 ԴՆԹ-ի մոլեկուլին):) և բուն բուֆերային համակարգը, որում հնարավոր են բոլոր ռեակցիաները։
PCR-ն բաղկացած է երեք քայլից՝ դենատուրացիա, պրայմերային կռում և երկարացում:
1. Դենատուրացիա. Ցելսիուսի 94-95 աստիճան ջերմաստիճանի դեպքում ԴՆԹ-ի երկու շղթաների միջև ջրածնային կապերը կոտրվում են, և արդյունքում ստանում ենք երկու միաշղթա մոլեկուլ։
2. Այբբենարանի կռում. Ցելսիուսի 50-60 աստիճան ջերմաստիճանում պրայմերները կցվում են միաշղթա նուկլեինաթթվի մոլեկուլների ծայրերին՝ ըստ կոմպլեմենտարության տեսակի։:
3. Երկարացում. 72 աստիճան ջերմաստիճանում տեղի է ունենում դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի դուստր երկշղթա մոլեկուլների սինթեզ։
ԴՆԹ հաջորդականություն
Մոլեկուլային կենսաբանական հետազոտության մեթոդները հաճախ պահանջում են դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի մոլեկուլում նուկլեոտիդային հաջորդականության իմացություն: Գենետիկ կոդը որոշելու համար կատարվում է հաջորդականություն։ Ապագայի մոլեկուլային ախտորոշումը հիմնված կլինի մարդկանց հաջորդականության արդյունքում ձեռք բերված գիտելիքների վրա:
Տարբերում են հաջորդականության հետևյալ տեսակները՝
- Մաքսամ-Գիլբերտի հաջորդականություն;
- Sanger հաջորդականություն;
- pyrosequencing;
- nanoporeհաջորդականություն.
