Ի՞նչն է ընկած ԴՆԹ-ի հիբրիդացման հիմքում: Թեև երկշղթա ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը ընդհանուր առմամբ կայուն է ֆիզիոլոգիական պայմաններում, լաբորատոր պայմաններում այս պայմանների փոփոխությունը (սովորաբար շրջակա միջավայրի ջերմաստիճանի բարձրացմամբ) կհանգեցնի մոլեկուլների բաժանմանը առանձին շղթաների: Վերջիններս փոխլրացնող են միմյանց, բայց կարող են նաև լրացնել իրենց միջավայրում առկա այլ հաջորդականությունները: Շրջակա միջավայրի ջերմաստիճանի իջեցումը թույլ է տալիս միաշղթա մոլեկուլներին կռել կամ «հիբրիդացնել» միմյանց հետ: Սա ԴՆԹ-ի հիբրիդացման մեթոդն է։
Հայեցակարգը մոլեկուլային կենսաբանության տեսանկյունից
Գիտնականները, որոնք ներգրավված են ինչպես ԴՆԹ-ի վերարտադրման, այնպես էլ ԴՆԹ-ի ՌՆԹ-ի տրանսկրիպացիայի մեջ, հիմնվում են նուկլեոտիդային խաչմերուկների և մոլեկուլային կենսաբանության տեխնիկայի վրա: Սա ներառում է հարավային և հյուսիսային բծերը, պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) և ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդացման և հաջորդականացման մոտեցումների մեծ մասը:
Դիմում
Հիբրիդացումը նուկլեոտիդի հիմնական հատկությունն էհաջորդականություն և օգտագործվում է մոլեկուլային կենսաբանության բազմաթիվ մեթոդներում։ Երկու տեսակների ընդհանուր գենետիկական կապը կարող է որոշվել նրանց ԴՆԹ-ի հատվածների հիբրիդացման միջոցով (ԴՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդացում): Մերձավոր փոխկապակցված օրգանիզմների միջև հաջորդականության նմանության պատճառով ԴՆԹ-ի նման հիբրիդները հալեցնելու համար ավելի բարձր ջերմաստիճան է պահանջվում՝ համեմատած ավելի հեռավոր օրգանիզմների հետ: Տարբեր մեթոդներ օգտագործում են հիբրիդացում ԴՆԹ-ի նմուշի ծագումը որոշելու համար, ներառյալ պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR): Մեկ այլ մեթոդով ԴՆԹ-ի կարճ հաջորդականությունները հիբրիդացվում են բջջային mRNA-ի հետ՝ բացահայտելու արտահայտված գեները: Դեղագործական ընկերությունները ուսումնասիրում են հակասիտային ՌՆԹ-ի օգտագործումը՝ անցանկալի mRNA-ին միանալու համար՝ կանխելով ռիբոսոմը mRNA-ն սպիտակուցի վերածելու համար:
ԴՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդացումն ընդհանուր առմամբ վերաբերում է մոլեկուլային կենսաբանության տեխնիկայի, որը չափում է գենետիկական նմանության աստիճանը ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների լողավազանների միջև: Այն սովորաբար օգտագործվում է երկու օրգանիզմների միջև գենետիկ հեռավորությունը որոշելու համար: Այն լայնորեն կիրառվում է ֆիլոգենիայի և տաքսոնոմիայի մեջ։
Մեթոդաբանություն
Մեկ օրգանիզմի
ԴՆԹ-ն պիտակավորվեց, այնուհետև խառնվեց չպիտակավորված ԴՆԹ-ի հետ, որը կարելի էր համեմատել դրա հետ: Խառնուրդը ինկուբացվում է, որպեսզի ԴՆԹ-ի շղթաները տարանջատվեն, այնուհետև սառչեն՝ ձևավորելով վերականգնված հիբրիդային երկշղթա ԴՆԹ: Նմանության բարձր աստիճանով հիբրիդացված հաջորդականությունները ավելի ամուր կկապվեն և ավելի շատ էներգիա կպահանջեն դրանք առանձնացնելու համար.ջերմաստիճանը, քան տարբեր հաջորդականությունները, գործընթաց, որը հայտնի է որպես «ԴՆԹ-ի հալում»:
ԴՆԹ-ի հալում
Գնահատելով հիբրիդացված ԴՆԹ-ի հալման պրոֆիլը, երկշղթա ԴՆԹ-ն կապվում է այսպես կոչված «սյունակի» հետ և ստացված խառնուրդը տաքացվում է: Յուրաքանչյուր քայլում սյունը լվանում է, և ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները, որոնք հալվում են, դառնում են միաշղթա և լվանում սյունը: Ջերմաստիճանը, որով պիտակավորված ԴՆԹ-ն դուրս է գալիս սյունակից, արտացոլում է հաջորդականությունների միջև եղած նմանության չափը (և ինքնուրույն ծալվող նախշը ծառայում է որպես հսկիչ): Այս արդյունքները համակցվում են՝ որոշելու օրգանիզմների գենետիկական նմանության աստիճանը։ Համաձայն ժամանակակից մանրէաբանության՝ ԴՆԹ-ի հիբրիդացումն անհնար է առանց այս բաները հասկանալու։
Երբ այս կերպ համեմատվում են ռիբոնուկլեինաթթվի (կամ դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի) բազմաթիվ տեսակներ, նմանության արժեքները թույլ են տալիս տեսակներին տեղավորել ֆիլոգենետիկ ծառի մեջ: Ուստի սա մոլեկուլային սիստեմատիկա վարելու հնարավոր մոտեցումներից մեկն է։ Չարլզ Սիբլին և Ջոն Ահլքվիսթը՝ այս տեխնիկայի առաջամարտիկները, օգտագործել են ԴՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդացում՝ ուսումնասիրելու թռչունների ֆիլոգենետիկ փոխհարաբերությունները (Սիբլի-Ալքվիստական դասակարգում) և պրիմատների:
Կարևորություն կենսաբանության համար
ԴՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդացումը բակտերիալ տեսակների տարբերակման ոսկե ստանդարտն է, որի նմանության արժեքն ավելի քան 70% է, ինչը ցույց է տալիս, որ համեմատվող շտամները պատկանում են տարբեր տեսակների: 2014 թվականին բակտերիաների ենթատեսակի առանձնացման համար առաջարկվել է 79% նմանության շեմ:
Քննադատները պնդում են, որ տեխնիկան ճշգրիտ չէ սերտորեն կապված տեսակների համեմատության համար, քանի որ օրգանիզմների միջև ուղղագրական հաջորդականությունների միջև տարբերությունները չափելու ցանկացած փորձ ճնշված է օրգանիզմի գենոմում պարալոգային նմանակների հիբրիդացումով: ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը և հաշվողական հաջորդականության համեմատությունները ներկայումս գենետիկ հեռավորությունը որոշելու սովորաբար օգտագործվող մեթոդն են, թեև այս մոտեցումը դեռևս օգտագործվում է մանրէաբանության մեջ՝ բակտերիաների նույնականացման համար:
Ներկայիս եղանակը ԴՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդացումն է սիլիկոնում, օգտագործելով ամբողջությամբ կամ մասամբ հաջորդականացված գենոմները: DSMZ-ի կողմից մշակված GGDC-ն ամենաճշգրիտ հայտնի գործիքն է DDH-ի նման արժեքները հաշվարկելու համար: Ի թիվս այլ ալգորիթմական բարելավումների, այն լուծում է պարալոգային հաջորդականությունների հետ կապված խնդիրը՝ զգուշորեն զտելով դրանք երկու գենոմի հաջորդականությունների համընկնումներից:
FISH մեթոդ
Fluorescence In Situ հիբրիդացումը (FISH) լաբորատոր տեխնիկա է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի հայտնաբերման և հաջորդականության համար, հաճախ որոշակի քրոմոսոմի վրա:
1969 թվականին Ջոզեֆ Գալը և Մերի Լու Պարդուն հրապարակեցին մի փաստաթուղթ, որը ցույց էր տալիս, որ ռիբոսոմային ԴՆԹ-ի հաջորդականության ռադիոակտիվ պատճենները կարող են օգտագործվել գորտի ձվի միջուկում լրացուցիչ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները հայտնաբերելու համար: Այս օրիգինալ դիտարկումներից ի վեր բազմաթիվ ճշգրտումներ մեծացրել են բազմակողմանիությունը ևընթացակարգի զգայունությունն այն աստիճանի, որ in situ հիբրիդացումը («տեղում», լատիներեն) այժմ համարվում է կարևոր գործիք ցիտոգենետիկայի մեջ: (Այժմ in situ տերմինը օգտագործվում է նաև կարցինոմայի աճի սկզբնական փուլին, երբ պաթոլոգիական գործընթացում ներգրավված է միայն էպիթելային հյուսվածքը:)
Լյումինեսցենտային հիբրիդացման հաջորդականություն
ՌՆԹ-ի զոնդերը կարող են նախագծվել ցանկացած գենի կամ գենի ցանկացած հաջորդականության համար՝ հյուսվածքներում և բջիջներում lncRNA-ն և miRNA mRNA-ն պատկերացնելու համար: FISH-ն օգտագործվում է՝ ուսումնասիրելով բջիջների վերարտադրության ցիկլը, մասնավորապես միջուկային ինտերֆազը՝ ցանկացած քրոմոսոմային անոմալիաների համար: FISH-ը թույլ է տալիս վերլուծել արխիվային դեպքերի մեծ շարք, շատ ավելի հեշտ է նույնականացնել հայտնաբերված քրոմոսոմը՝ ստեղծելով արհեստական քրոմոսոմային հիմքով զոնդ, որը կգրավի նմանատիպ քրոմոսոմներ։
Հիբրիդացման ազդանշաններ յուրաքանչյուր զոնդի համար, երբ հայտնաբերվում է միջուկային աննորմալություն. mRNA և lncRNA հայտնաբերման յուրաքանչյուր զոնդ բաղկացած է 20 զույգ օլիգոնուկլեոտիդներից, յուրաքանչյուր զույգ ընդգրկում է 40-50 bp տարածություն: p. Զոնդերը օգտագործում են հատուկ քիմիա mRNA-ն հայտնաբերելու համար:
Հիբրիդացում ԴՆԹ-ի զոնդերով
Զոնդերը հաճախ պատրաստվում են ԴՆԹ-ի բեկորներից, որոնք մեկուսացվել, մաքրվել և ուժեղացվել են մարդու գենոմի նախագծման մեջ օգտագործելու համար: Մարդու գենոմի չափը այնքան մեծ է երկարության համեմատ, որը կարելի է ուղղակիորեն հաջորդականացնել, որ անհրաժեշտ է այն բաժանելբեկորներ. Ի վերջո, այս բեկորները պատվիրվել են՝ մարսելով յուրաքանչյուր հատվածի պատճենը նույնիսկ ավելի փոքր միավորների՝ օգտագործելով հաջորդականության հատուկ էնդոնուկլեազներ՝ չափելու յուրաքանչյուր փոքր հատվածի չափը՝ օգտագործելով չափի բացառման քրոմատոգրաֆիա՝ օգտագործելով այս տեղեկատվությունը, որոշելու, թե որտեղ են մեծ բեկորները համընկնում միմյանց հետ:
Էլեմենտները իրենց առանձին ԴՆԹ-ի հաջորդականությամբ պահպանելու համար բեկորները ավելացվել են անընդհատ կրկնվող բակտերիաների պոպուլյացիաների համակարգին: Բակտերիաների կլոնային պոպուլյացիաները, որոնցից յուրաքանչյուրը պահպանում է մեկ արհեստական քրոմոսոմ, պահվում են աշխարհի տարբեր լաբորատորիաներում: Արհեստական քրոմոսոմները (BACs) կարելի է աճեցնել, արդյունահանել և պիտակավորել գրադարան պարունակող ցանկացած լաբորատորիայում: Գենոմային գրադարանները հաճախ անվանում են այն հաստատությունների անունով, որտեղ դրանք ստեղծվել են: Օրինակ՝ RPCI-11 գրադարանը, որն անվանվել է Բուֆալոյի Ռոսվելի քաղցկեղի ինստիտուտի պատվին (Նյու Յորք, ԱՄՆ): Այս բեկորները կազմում են մոտ 100 հազար բազային զույգ և հանդիսանում են ՁԿՆ զոնդերի մեծ մասի հիմքը։
